第一次做熒光素酶檢測實驗的小伙伴，可能會面臨很多的問題。那么，究竟如何入門該實驗，您又有哪些需要注意的問題了？今天小艾帶您來一探究竟。
什么是螢光素/螢光素酶檢測?它如何起作用？
在自然界中，當化學能轉化為光能時，就會發生生物發光。螢火蟲，真菌和海洋生物等許多生物都出于多種原因出現生物發光。當螢光素酶催化螢光素的氧化導致發光時，就會發生該過程。反應機理如下圖所示：
螢光素酶檢測的主要用途是什么？
螢光素酶是檢測啟動子強度和活性的好方法。例如，如果您想研究啟動子區域內的轉錄，可以將熒光素酶基因置于啟動子后面。轉錄該基因后，您將根據產生的熒光強度知道自己是否具有強大的啟動子。檢測中產生更強的熒光意味著更多的熒光素酶被轉錄，這意味著您具有更強的啟動子。 您也可能會遇到的另一個問題是，如果要檢測基因表達，何時選擇熒光素酶測定法，何時選擇qPCR。要記住的是：qPCR方法將測量基因的轉錄本。它不會告訴您轉錄的控制。但是，使用螢光素酶可以測量啟動子的和轉錄調控。還要考慮的另一件事是，您想要研究基因調控的深度。您可能會發現，必須同時執行這兩種技術才能了解項目的主要方面。
我需要怎么進行熒光素酶檢測？
| 領域 | 研究類型 | 試劑 | 儀器 | 孔板/管 |
| 生物光學成像 | 細胞、活體動物（如：小鼠） | 熒光素酶檢測試劑/熒光素酶檢測試劑盒 | 酶標儀/單管發光儀 | 微孔板/微量離心管 |
| 注：1.試劑：您可以選擇一個試劑盒來進行實驗，它會包含您需要的所有必要成分；您也可以選擇試劑，再配制或購買其他實驗中的必要成分。如果您購買的是單獨的產品，那么我們建議您考慮質量，尤其是在熒光素方面。純度的差異會產生影響。而試劑盒具有相當大的便利性，例如，您不必制作緩沖液，因為試劑盒中已經提供了它。制備螢光素儲液時，無需稱量，因為您的螢光素已經過測量。它還在您的實驗設置中提供了統一性。2.儀器：首先檢查您的儀器是酶標儀還是單管發光檢測儀，確認您的儀器是否帶有進樣器。同時取人您的儀器在什么波長下工作以及在什么溫度下工作。所有這些都將幫助您進一步規劃實驗。（酶標儀可以讀取孔板中的樣品。通常范圍在96到384孔之間；單管發光檢測儀，將讀取單個微量離心管。）3.孔板/管：對于這種測定類型，必須使用平底的板（不要使用圓底或者V型底的孔板）。它們是專門為光學檢查和細胞培養應用而設計的。透明的孔板使您可以看到裂解物，但缺點是相鄰的孔中的背景可能會影響您的觀察。白色的孔板可以防止出現這種背景。但是看不到自己的裂解物。底部透明的白板可以解決可見性和背景問題。 |
螢光素酶檢測的推薦步驟：
首先需要確認您是進行雙重報告基因檢測還是單個報告基因檢測。熒光素酶檢測的建議步驟如下：
| a. 選擇熒光素酶報道基因（螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶等）。如果要進行雙重報告基因檢測，則螢光素酶需要進行不同的光譜檢查。 b. 將報告基因克隆到質粒中。如果您要進行雙重報告基因檢測，則將其他報告基因克隆到單獨的質粒中。 c. 將質粒與實驗細胞共轉染。 d. 經過24至48小時培養后，取出培養基并裂解細胞。 e. 將包含螢光素的緩沖液添加到裂解物中，使用酶標儀進行檢測。 |
上述步驟是建議的一般步驟，實際情況應根據具體的分析類型和實驗設計，對實驗方法進行相應的調整。
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