線粒體基質蛋白靶向降解新方法

       近年來，開發蛋白靶向降解技術成為藥物研發新的熱門方向。蛋白降解技術的研究使得許多已知的不可成藥靶點成為可成藥靶點，并有望克服耐藥性問題。蛋白靶向降解技術的研究主要是用于去除特定腫瘤蛋白，在自身免疫疾病等治療方面的研究也取得了較大的突破。

       如何通過作用于絕大多數的不可成藥靶點來開發藥物成為許多公司的研發重點，當前研究最多的是利用核酸藥物或基因治療的手段，對這些靶點的基因水平進行控制，以達到控制靶點蛋白水平的目的。

       細胞內蛋白降解途徑主要有溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin - proteasome system , UPS）。其中，泛素-蛋白酶體系統是體內蛋白降解的主要途徑，體內80%的蛋白通過該途徑降解。因此，蛋白降解技術相關的研究也主要圍繞此途徑開展，相關項目進展也更快。

       蛋白靶向降解（TPD）技術不僅可以靶向傳統意義上不可成藥的蛋白，而且相比于蛋白活性抑制劑可以更為徹底地阻斷靶蛋白的生物功能，是近年來藥物研發的熱點。目前TPD蛋白降解劑主要依賴泛素-蛋白酶體（如蛋白水解靶向嵌合體PROTACs）或者溶酶體（如溶酶體靶向嵌合體LYTACs)，而這兩者是真核細胞有膜細胞器（如線粒體、葉綠體、過氧化物酶體等）內所不具備的。因此目前已有的蛋白靶向降解技術對于有膜細胞器內特定蛋白的降解無能為力。近日，中科院杭州醫學所的方曉紅團隊利用線粒體基質中豐富的AAA+蛋白水解酶，發展了一種具有普適性、可模塊化設計的線粒體基質蛋白靶向降解新方法。

       線粒體被稱為細胞的能量工廠，至今已在線粒體中發現1000多種蛋白質，廣泛參與細胞的生長、運動、應激響應等生物學過程。線粒體蛋白的異常是諸如神經退行性疾病、腫瘤等惡性疾病的重要驅動因素。靶向調控線粒體基質蛋白的穩定性及降解在疾病治療和藥物開發中具有重要價值。雖然線粒體基質不具有泛素-蛋白酶體或者溶酶體，但是富集了多種由細胞核基因編碼的AAA+蛋白酶（如ClpP、LONP1等）。線粒體內部主要通過這些AAA+蛋白酶對靶蛋白進行水解切割，以精確控制線粒體的蛋白穩態。同時在細胞應激狀態下，胞漿中大量變性蛋白質被也會被轉運到線粒體基質中，經由AAA+蛋白酶進行快速降解。以上特性提示可利用這一類AAA+蛋白酶發展線粒體基質蛋白適用的靶向降解技術。

       在針對腫瘤標志物的前期研究中，科技部納米重大科學研究計劃項目首席科學家（2007-2017）方曉紅教授團隊，在針對腫瘤標志物的前期研究中，通過發展核酸適體技術、高通量蛋白抑制劑篩選技術等，發現可以通過小分子化合物誘導線粒體基質蛋白經由AAA+蛋白酶快速降解，證明了利用AAA+蛋白酶來靶向降解線粒體基質蛋白的可行性（J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 18492-18499）。然而上述線粒體基質蛋白小分子降解劑需要針對不同蛋白進行個性化的高通量篩選才能獲得，開發更為普適性的、可模塊化設計的線粒體基質蛋白降解新方法具有重要意義。

       研究團隊借鑒經典的PROTAC分子結構，設計了能夠誘導線粒體基質靶蛋白與AAA+蛋白酶相互作用并高效水解的線粒體蛋白酶靶向嵌合體MtPTAC。以AAA+蛋白酶中水解能力最強的ClpP為蛋白降解機器，以定位于線粒體內并具有促進腫瘤生長功能的線粒體RNA聚合酶POLRMT為靶蛋白，合成了由聚乙二醇PEG鏈連接ClpP和POLRMT配體的MtPTAC分子。利用多種細胞系證實了設計合成的MtPTAC分子具備強大的線粒體基質靶蛋白降解能力。進一步表征分析了MtPTAC的濃度、時間以及PEG鏈長對靶蛋白切割降解效率的影響。通過細胞FRET成像、分子動力學模擬等探究了MtPTAC降解靶蛋白的分子機制，證實合理設計的MtPTAC分子可以拉近靶蛋白POLRMT與AAA+蛋白酶ClpP的空間距離，并觸發ClpP依賴性的POLRMT水解。高通量蛋白組學實驗結果表明這種水解具有較好的特異性，對線粒體其他蛋白的表達量影響小。最后通過體外細胞實驗與小鼠體內成瘤實驗，證實MtPTAC分子在體內可通過對靶蛋白的切割降解展示出比單獨使用靶蛋白活性抑制劑更強的抗腫瘤能力。

       線粒體基質蛋白靶向降解MtPTAC技術為線粒體相關疾病的治療提供了新思路。值得注意的是，過去報道的蛋白降解劑只是拉近了靶蛋白與蛋白降解器之間的空間距離，而MtPTAC中使用的AAA+蛋白酶結合配體還可直接增強其水解酶活性，是首個結合-激活型小分子降解劑。綜上，該工作發展了一種新的細胞器靶蛋白降解技術，為TPD提供了一個新的平臺策略。

       上述研究工作近期發表于J. Am. Chem. Soc.上，第一作者為中科院杭州醫學所博士生王大馳（與中國科學技術大學聯合培養）和博士后王文溪，通訊作者為中科院杭州醫學所單分子生物醫學研究團隊的方曉紅研究員和周衛副研究員。本工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金委以及浙江省自然科學基金項目的資助。

       文獻參考：

       Mitochondrial Protease Targeting Chimeras for Mitochondrial Matrix Protein Degradation

       Dachi Wang, Wenxi Wang, Le Fang, Lubin Qi, Yuchao Zhang, Jie Liu, Yuxin Liang, Hongwei Yang, Mengjie Wang, Xiaojian Wei, Ruibin Jiang, Yuan Liu, Wei Zhou*, and Xiaohong Fang*

       J. Am. Chem. Soc., 2023, DOI: 10.1021/jacs.3c03756