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蛋白質印跡手冊之三:印跡原理與優化

發布者:艾美捷科技    發布時間:2023-06-13     
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將蛋白質上樣到膜上的直接方法是通過過濾,一個溶解的樣品可以通過抽真空而濾過膜。蛋白質吸附到膜上,而樣品的其他組分則穿過膜?;蛘?,將樣品直接點在表面上,并讓其干燥。固定在膜上的蛋白質隨后可用于分析。


過濾(抽濾)

將蛋白質上樣到膜上的直接方法是通過過濾,一個溶解的樣品可以通過抽真空而濾過膜。蛋白質吸附到膜上,而樣品的其他組分則穿過膜(圖1)?;蛘?,將樣品直接點在表面上,并讓其干燥。固定在膜上的蛋白質隨后可用于分析。

 

利用過濾的印跡系統

圖1. 利用過濾的印跡系統


斑點印跡(圖2)和狹縫印跡是過濾方法的兩個版本,它們采用多管吸印儀(manifold),將樣品以斑點狀或狹縫狀上樣到膜上。這些技術被作為快速篩選大量樣品的定性方法,或分析相似樣品的定量技術。它在測試實驗設計參數是否適用于更復雜分析時特別有用。

檢測轉鐵蛋白

圖2. 利用Western 化學發光HRP底物在人血清的斑點印跡上檢測轉鐵蛋白(詳見操作步驟1.4 斑點印跡)。利用山羊抗轉鐵蛋白抗體和兔抗山羊HRP結合的二抗,在P轉印膜上檢測連續稀釋血清中的轉鐵蛋白,重復兩次。


過濾方法的另一個版本是網格免疫印跡,當樣品量非常有限,無法用ELISA等傳統技術來開展分析時,這種技術很有用,適合高度并行的樣品分析。例如,網格免疫印跡已用于過敏原特異的抗體應答鑒定,只需要極少量的患者血清。


在制備過濾法印跡時,請注意以下方面:

? 去污劑會抑制蛋白質吸附到膜上。樣品溶解和清洗所用的緩沖液中的去污劑應不超過0.05%,且只在需要時添加。

? 樣品量應足夠大,以覆蓋每孔中暴露的膜,但又不能超過膜的結合能力。

? 顆粒負載高的樣品可能會堵塞膜,而那些高粘度的樣品會降低流速。顆粒應通過預過濾或離心來去除,并只將上清上樣到膜上。粘稠的樣品應用緩沖液稀釋。

 

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